Rivaliseringen
Mens kong Mitridate er borte og kjemper mot romerne, har hans to sønner begge blitt forelsket i Aspasia, kongens forlovede. Sifare, den yngre sønnen, lider i torturert stillhet — han elsker Aspasia, men vil ikke vanære sin far. Farnace, den eldre, har ingen slike skrupler: han frier åpent til Aspasia og har hemmelig alliert seg med Roma. Aspasia selv er fanget: hun gjengjelder Sifares kjærlighet, men er bundet av plikt til den fraværende kongen. Guvernøren Arbate prøver å opprettholde freden, men brødrenes rivalisering spiralerer mot katastrofe.
Mitridate's Return
Mitridate kommer tilbake fra krigen kronet med laurbær — men seieren i utlandet kan ikke skjule sviket hjemme. Han merker umiddelbart at noe er galt. Arbate informerer ham om Farnaces svik: hans eldste sønn har vært forelsket i Aspasia og konspirerer med Roma. Kongens hjemkomst blir bitter. I mellomtiden ser Ismene, den parthiske prinsessen lovet til Farnace, på at forlovede hennes ignorerer henne og forfølger den andre kvinnen. Hun bærer avvisningen med stille verdighet.
Mistanke og test
Mitridate bekrefter sine mistanker om Farnace og eksploderer av raseri. Men kongens vrede er både beregnende og intens — han finner på en grusom test for Aspasia, og later som han frigir henne fra forlovelsen for å se om hun vil avsløre sine sanne følelser. Farnace, tatt på fersken, begynner å føle de første stikkene av skyld. Den politiske alliansen med Roma som virket så smart, ser nå ut som en snare.
Sifare og Aspasia
Sifare og Aspasia møtes for det de tror kan være siste gang. Sifare må dra — farens mistanke vokser — og farvellet er ødeleggende. Han synger operaens vakreste arie, og avslører endelig dybden av sin kjærlighet. Aspasia, som er alene, kjemper med sin umulige situasjon i musikk av ekstraordinær følelsesmessig kraft. De to mest sympatiske karakterene i operaen blir knust av krefter utenfor deres kontroll.
Mitridates vrede
Den fulle sannheten kommer frem: begge sønnene elsker Aspasia. Farnace innrømmer sin skyld, men det er for sent for bekjennelse til å hjelpe. Mitridate, sviktet av sitt eget blod, fratar seg selv all nåde. Han dømmer Aspasia til døden og erklærer at ingen av sønnene vil bli skånet. Kongens raseri er totalt og skremmende — krigeren som møtte Romas legioner uten å blunke, blir ødelagt av svik fra sin egen familie.
Elskerne
Med døden truende har Sifare og Aspasia ingenting mer å skjule. De erklærer sin kjærlighet åpent i en duett av hjerteskjærende ømhet — hvis de ikke kan leve sammen, vil de møte hva som helst side om side. Det er den følelsesmessige klimaks i operaen: to mennesker som velger kjærlighet fremfor overlevelse, deres stemmer veves sammen i musikk som overskrider konvensjonene til opera seria.
Slaget
Romerne angriper. Mitridate, til tross for alt, rir ut for å møte sin livslange fiende en siste gang. Sifare, som beviser sin lojalitet gjennom handling, kjemper ved sin fars side. Selv Farnace, forvandlet av skyld og Ismenes tålmodige kjærlighet, vender seg mot sine romerske allierte og slutter seg til kampen. Marzios siste fristelse faller på døve ører. Aspasia, som tror alt er tapt, vurderer å ta sitt eget liv i stedet for å underkaste seg et tvunget ekteskap.
Forsoning
Mitridate blir båret tilbake fra slagmarken, dødelig såret men seirende. I sine siste øyeblikk gjør den døende kongen det som virket umulig: han tilgir begge sønnene. Han velsigner ekteskapet mellom Sifare og Aspasia, anerkjenner Farnaces frelse, og dør med å erklære at Pontus aldri vil gi etter for Capitol. Den fjorten år gamle Mozart forvandlet en konvensjonell lieto fine til noe genuint rørende — en fars siste gave til barna som sviktet ham.